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一、原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELLSA試劑盒是一種固相酶免疫測(cè)定的方法，目前廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的檢測(cè)。其基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體表面，并保持其免疫活性，再與酶標(biāo)記抗體或抗原聯(lián)結(jié)，并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，反應(yīng)顏色的深淺可與相應(yīng)抗原或抗體的量相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，（1）用已知抗體包被固相載體；（2）加入受檢的標(biāo)本（含待測(cè)抗原），使抗原與固相上的抗體結(jié)合；（3）加入以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的已知抗體，使之與抗原結(jié)合。標(biāo)記的酶可催化底物（四甲基聯(lián)苯胺）起顯色反應(yīng)，從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。

二、器材與試劑

器材：

（1）50~250μl可調(diào)微量移液器與移液頭（2）37℃培養(yǎng)箱、搪瓷盒（3）酶標(biāo)架（4）洗瓶（含洗滌液）、吸水毛巾（5）酶標(biāo)檢測(cè)儀

試劑：

（1）已包被抗體的酶標(biāo)條（2）400μg/L抗原溶液（3）抗原稀釋液（4）待測(cè)標(biāo)本1、2（5）酶標(biāo)抗體（6）洗滌液（pH7.2 PBS-Tween 20）（7）底物A、B溶液（8）終止液

三、操作步驟

ELLSA試劑盒取已包被抗體的酶標(biāo)板，分別在第1~6孔各加入抗原稀釋液100 ul，第6、7孔各加入400μg/L抗原溶液100 ul，從第6~2孔進(jìn)行對(duì)倍稀釋?zhuān)▃ui后在第2孔吸出的100 ul棄去）；在第8、9孔各加入100 ul待測(cè)標(biāo)本1；在第10、11孔各加入100 ul待測(cè)標(biāo)本2。置酶標(biāo)板于37℃，保溫30分鐘。

棄去孔內(nèi)液體，以洗滌液注滿(mǎn)孔內(nèi)，置3分鐘后甩干孔內(nèi)液體，重復(fù)3遍。上述孔內(nèi)再加入酶標(biāo)抗體100ul。置37℃，保溫30分鐘。

棄去孔內(nèi)液體，以洗滌液注滿(mǎn)孔內(nèi)，置3分鐘后甩干孔內(nèi)液體，重復(fù)4遍。

各孔均加底物A和底物B溶液各100ul，混勻。置37℃，10分鐘左右加入終止液50ul 中止反應(yīng)。

將酶標(biāo)板置酶標(biāo)儀上比色，以第1孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng)處讀取光密度值（O.D值）。

結(jié)果判斷：以O(shè).D值為縱坐標(biāo)，抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度（0;12.5;25;50;100;200;400μg/L）為橫坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再根據(jù)樣品的平均O.D值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出各自的含量。

四、ELLSA試劑盒操作注意事項(xiàng)

正確掌握微量移液器的使用方法：吸液時(shí)將按鈕按至*止點(diǎn)，排液時(shí)則應(yīng)盡力按足按鈕（至第二止點(diǎn)）。

酶標(biāo)板的正確洗滌：加洗滌液時(shí)應(yīng)小心，勿使洗滌液溢出，流入周?chē)字?，造成交叉污染。洗滌后?yīng)盡量甩干孔內(nèi)殘液。洗滌液加入孔后，須保持三分鐘再棄去。

注意加樣順序，加樣品時(shí)應(yīng)注意從zui高稀釋度逐一加至zui低稀釋度。