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酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELLSA試劑盒—雙抗體夾心法
更新時(shí)間:2013-08-20   點(diǎn)擊次數(shù):2447次

一、原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELLSA試劑盒是一種固相酶免疫測(cè)定的方法,目前廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的檢測(cè)。其基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體表面,并保持其免疫活性,再與酶標(biāo)記抗體或抗原聯(lián)結(jié),并保留酶的活性,然后加入酶反應(yīng)的底物,后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,反應(yīng)顏色的深淺可與相應(yīng)抗原或抗體的量相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中,(1)用已知抗體包被固相載體;(2)加入受檢的標(biāo)本(含待測(cè)抗原),使抗原與固相上的抗體結(jié)合;(3)加入以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的已知抗體,使之與抗原結(jié)合。標(biāo)記的酶可催化底物(四甲基聯(lián)苯胺)起顯色反應(yīng),從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。


二、器材與試劑

器材:

(1)50~250μl可調(diào)微量移液器與移液頭(2)37℃培養(yǎng)箱、搪瓷盒(3)酶標(biāo)架(4)洗瓶(含洗滌液)、吸水毛巾(5)酶標(biāo)檢測(cè)儀

試劑:

(1)已包被抗體的酶標(biāo)條(2)400μg/L抗原溶液(3)抗原稀釋液(4)待測(cè)標(biāo)本1、2(5)酶標(biāo)抗體(6)洗滌液(pH7.2 PBS-Tween 20)(7)底物A、B溶液(8)終止液


三、操作步驟

ELLSA試劑盒取已包被抗體的酶標(biāo)板,分別在第1~6孔各加入抗原稀釋液100 ul,第6、7孔各加入400μg/L抗原溶液100 ul,從第6~2孔進(jìn)行對(duì)倍稀釋?zhuān)▃ui后在第2孔吸出的100 ul棄去);在第8、9孔各加入100 ul待測(cè)標(biāo)本1;在第10、11孔各加入100 ul待測(cè)標(biāo)本2。置酶標(biāo)板于37℃,保溫30分鐘。

棄去孔內(nèi)液體,以洗滌液注滿(mǎn)孔內(nèi),置3分鐘后甩干孔內(nèi)液體,重復(fù)3遍。上述孔內(nèi)再加入酶標(biāo)抗體100ul。置37℃,保溫30分鐘。

棄去孔內(nèi)液體,以洗滌液注滿(mǎn)孔內(nèi),置3分鐘后甩干孔內(nèi)液體,重復(fù)4遍。

各孔均加底物A和底物B溶液各100ul,混勻。置37℃,10分鐘左右加入終止液50ul 中止反應(yīng)。

將酶標(biāo)板置酶標(biāo)儀上比色,以第1孔調(diào)零,在450nm波長(zhǎng)處讀取光密度值(O.D值)。

結(jié)果判斷:以O(shè).D值為縱坐標(biāo),抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度(0;12.5;25;50;100;200;400μg/L)為橫坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),再根據(jù)樣品的平均O.D值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出各自的含量。


四、ELLSA試劑盒操作注意事項(xiàng)

正確掌握微量移液器的使用方法:吸液時(shí)將按鈕按至*止點(diǎn),排液時(shí)則應(yīng)盡力按足按鈕(至第二止點(diǎn))。

酶標(biāo)板的正確洗滌:加洗滌液時(shí)應(yīng)小心,勿使洗滌液溢出,流入周?chē)字?,造成交叉污染。洗滌后?yīng)盡量甩干孔內(nèi)殘液。洗滌液加入孔后,須保持三分鐘再棄去。

注意加樣順序,加樣品時(shí)應(yīng)注意從zui高稀釋度逐一加至zui低稀釋度。


 

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