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ELISA試劑盒試劑配制研究方法
更新時(shí)間:2015-04-13   點(diǎn)擊次數(shù):1422次

    完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物);ELISA試劑盒酶的底物;陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品(定性測(cè)定中),參考尺度品和控制血清(定量測(cè)定中);酶聯(lián)物(結(jié)合物)及標(biāo)本的稀釋液;洗滌液;酶反應(yīng)終止液。ELISA中有三個(gè)必要的試劑:免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物等。
    疫吸附劑已包被抗原或抗體的固相載體在低溫(2~8℃)干燥的前提下一般可保留6個(gè)月以上??勺鱁LISA中載體的材料良多,zui常用的是聚苯乙烯。ELISA試劑盒以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離,洗滌利便,ELISA試劑盒一般均配以特殊儀器。為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣,可應(yīng)用如下的試驗(yàn):用其他免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本,將它們進(jìn)行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操縱步驟進(jìn)行測(cè)定,然后比較結(jié)果。小試管還可以當(dāng)作比色杯,ELISA試劑盒zui后直接放入分光光度計(jì)中比色。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大進(jìn)步,因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕捉包被法,試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善,重復(fù)性亦佳。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的機(jī)能,抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍留存原來(lái)的免疫學(xué)活性,加之它的價(jià)格低廉,所以被普遍采用。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用力。控制反應(yīng)前提,使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差,應(yīng)小于10%。例如,在檢測(cè)抗DNA抗體時(shí),需用DNA作為包被抗原,而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè),并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。換言之,包被等于抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過(guò)程。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果差別zui大,這種載體就是這一ELISA測(cè)定項(xiàng)目的zui合適的固相載體。
    ELISA載體的外形主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附機(jī)能好,空缺值低,孔底透明度高,ELISA試劑盒各板之間、統(tǒng)一板各孔之間、統(tǒng)一板各孔之間機(jī)能相近。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于*反應(yīng)狀態(tài),因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為敏捷。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力,其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上,抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。 

    小試管作為固相載體也有較大的吸附表面,而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。在ELISA中,用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。當(dāng)抗原決定簇存在于或臨近于疏水區(qū)域時(shí),抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露,在這種情況下,直接包被效果不佳,可以采用間接的捕捉包被法,ELISA試劑盒即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被,其后通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。ELISA試劑盒聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附機(jī)能比聚苯乙烯高,但空缺值也略高。固相載體先用堿性蛋白質(zhì),如聚賴(lài)氨酸、魚(yú)精蛋白等作預(yù)包被,也可進(jìn)步核酸的結(jié)協(xié)力。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄,可剪割,價(jià)廉,但光潔度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。

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